氦氖激光器中工作物質是氦氣和氖氣，其中氦氣為輔助氣體，氖氣為工作氣體。產生激光的是氖原子，不同能級的受激輻射躍遷將產生不同波長的激光，主要有632.8nm、1.15um和3.39um三個波長。
氦原子有兩個亞穩態能級21S0、23S1，它們的壽命分別為5×10-6s和10-4s，在氣體放電管中，在電場中加速獲得一定動能的電子與氦原子碰撞，并將氦原子激發到21S0、23S1，此兩能級壽命長容易積累粒子。因而，在放電管中這兩個能級上的氦原子數是比較多的。這些氦原子的能量又分別與處于3S和2S態的氖原子的能量相近。處于21S0、23S1能級的氦原子與基態氖原子碰撞后，很容易將能量傳遞給氖原子，使它們從基態躍遷到3S和2S態，這一過程稱能量共振轉移。由于氖原子的2P、3P態能級壽命較短，這樣氖原子在能級3S－3P、3S－2P、2S－2P間形成粒子數反轉分布，從而發射出3.39um、632.8nm、1.5um三種波長的激光。 上述過程可表示為：
e**+He(11S0)→e*+He*(21S0)
e**+He(11S0)→e*+He*(23S0)
He*(21S0)+Ne(2P6)→He(21S0)+Ne*(3S)
He*(23S1)+Ne(2P6)→He(21S0)+Ne*(2S)
Ne*(3S)→Ne*(2P)產生波長為632.8nm的激光
Ne*(3S)→Ne*(3P)產生波長為3.39um的激光
Ne*(2S)→Ne*(2P)產生波長為1.15um的激光
從理論上講，這三種波長的激光都有可能發射，但我們可以采取一些方法去抑制其中的兩種，而使我們所需要的一種波長的激光得到輸出。632.8nm（紅光）因輸出為可見波段的激光，實際應用較廣泛。
