ELISA實驗質量控制問題
從1949年美國College of American Pathologists(簡稱CAP)首先開始研究臨床實驗
室室內質量控制(簡稱質控)問題，美國學者Levery和Jenning于1950年發表第一篇關于
使用質控圖的實驗室室內質控，臨床檢驗實驗室的室內質控工作正式拉序幕。
到70年代，實驗室質量控制進入一個新的階段--全面質量管理，推行Good
Laboratory Parctice(簡稱GLP)。進入80年代末期，GLP的統一標準產生了，發展
到"認證實驗室"管理階段。
全面質量管理的宗旨在于預防差錯的產生。質控圖的統計學質控的目的是檢出差錯。
統計學的實驗室室內質控是全面質量管理中的一個重要環節。
本章節主要介紹免疫學檢驗的統計學室內質控方法。因為ELISA是目前臨床上最常用
的一種免疫學檢驗方法，就以ELISA檢驗為例，介紹一下有關問題。
衛生部臨床檢驗中心免疫質控室從1988年開始在全國范圍內開展乙肝標志物檢驗的質
量評價活動，一直采用這一套質量評價方法，并在實踐中不斷實踐、提高和完善，希望能
找出一條適合中國國情的，行之有效的質量管理的道路。
5.1 基本概念
5.1.1 質量控制(Quaility Control,Q.C)
質量控制是監視全過程，排除誤差，防止變化，維持標準化現狀的一個管理過程。這
一過程是通過一個反饋環路進行的。
1)確定控制的對象；
2)規定控制對象的標準(預期值)；
3)制定或選擇控制方法和手段；
3)測量實際數據；
4)比較或較對實際數據與預期值之間的差異，并說明產生這一差異的原因。超出預
定誤差范圍，報警系發出信號，反饋通道中斷。
5)采取行動，解決差異。恢復原狀(原標準狀態)的手段發揮作用。
質量控制主要采用質控圖進行。質控圖是把某一檢驗的性能數據與所計算出來的預期
的"控制限"進行比較的圖。這種性能數據是在按規程正常進行時，按時間順序而抽選出來
的，其目的是檢測檢驗過程中變異的"可追查"性原因。"可追逆"性的誤差原因，是指除去
隨機誤差以外的其他原因。"控制限"是通過統計計算出來的，在后我們將詳細介紹(見
5.3.室內質控程序)。
5.1.2 誤差
實驗誤差分為三種：系統誤差、隨機誤差和過失誤差。
系統誤差是指一系列測定結果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規律
性，可在一定條件下重復出現，是可以通過質控預防和校正的。
隨機誤差又稱偶然誤差，是一種偶然的、未能預料到的誤差，是難以避免和校正的誤
差。檢驗工作中隨機誤差的分布符合正態分布規律。
過失誤差是人為的責任誤差。通過加強實驗室管理和開展質量控制工作是可以避免
的。
5.1.3 正態分布及標準差
ELISA試驗中，檢驗同一樣本達20次以上時，就會發現這組數據(指測定結果的吸光
值)分布在均值兩側，大部分集中在均值附近。如果以測定值為橫坐標，以出現的頻率為
縱坐標作圖，就可繪出一個呈鐘形的曲線圖。如圖5-1，鐘頂處為均值，其他值以均值為
中心對稱分布，這就是正態分布。
正態曲線以下的面積稱概率，常用樣本的均數(X)和標準差(SD)來表示，其計算
方法如下：
均值、標準差和概率的關系如下：
X±1SD，概率0.68 X±2SD，概率0.95 X±3SD，概率0.99
換言之，當ELSIA檢測同一樣本達一定次數后所得的一組數據，其中靠近均值(X)的
±1SD范圍內的數據，占該組數據的68%，在X±2SD范圍內分布的數據占總體的95%，
在X±3SD范圍內分布的數據占總體的99%。當我們要求檢驗結果在X±2SD范圍內為合格
時，將有95%的數據可能合格。
5.1.4 真值
用確切的、最理想的決定性方法測得的值，稱為真值。真值一般是測不到的。通過可
靠的決定性方法測出的值，稱為靶值，通常用靶值來表示真值的大小。
5.1.5 準確度(accuracy)
是指測定結果與真值(或靶值)接近的程度。準確度不能以數字表示，往往用不準確
度來衡量。測定結果與靶值的偏離程度稱為偏差，它表示該項檢驗的不準確度。
絕對偏差=檢驗的均值-真值(或靶值)
相對偏差=絕對偏差真值÷(或靶值)×100%
5.1.6 精密度(Precision)
是指對同一樣本重復測定時，每次測定結果與平均值的接近程度，即重復測定值之間
的符合程度。
5.1.7 標準品
1、國際標準品 由WHO或相應組織標定的，用肯定的、公認的、準確的物理或化學方法
測定的定值材料。
2、國際生物學活性標準品根據生物學反應由WHO或相應組織標定的國際活性單位的材
料。
3、參考標準血清 國家標準化組織根據國際標準化生產的法定材料。可用于鑒定儀器和
鑒定方法準確性。
5.1.8 臨床決定性水平(clinical decision leuel)
當某個被測物的濃度達到某一水平時，臨床醫師必須采用醫療措施。被測物的這濃度
稱為臨床決定性水平。
5.2質量控制血清
質控血清是已有靶值的血清，在每次的常規檢驗中加入一份或數份，通過所得結果來
了解本次檢驗的情況。質控血清檢驗的結果如能控制其誤差在一定范圍內，就說明該檢驗
沒有發生不允許的誤差。如果出現超過允許誤差范圍的異常結果，提示該檢驗不合格，應
尋找原因，糾正后，重檢待測標本。因此質控血清在質控工作中起重要作用。
5.2.1 質控血清的使用
衛生部臨床檢驗中心制備的乙肝標志物質控血清，可以在-20℃保持半年定值不變。
冰凍狀態融化使用時，應先混勻，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反復冰融或自行分
裝。開展某項檢驗的室內質控工作需要的質控血清，一般按3-6個月用量準備。自制的不
定值質控血清，在一批質控血清將用完之前，需準備下一批質控血清。質控血清要求性能
穩定，較長期內效價不變，其理化性質應與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監測作
用。
5.2.2 臨界值質控血清
質控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質控血清定值，一般定在正常值與異常
值交界點上，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標志物臨界值的制定，應按
臨床要求，為臨床提供統一的判斷弱陽性的標準。
臨界值質控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個對照品，它可
以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應的標本不漏檢。
5.2.3 質控血清的制備
每個實驗室可以根據自己的條件，選用臨床中心提供的質控血清，或按以下方法自己制備
本室使用的質控血清(以乙肝質控血清為例)。
1) 收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細菌污染的陽性血清。
2) 56℃加熱10小時來活。
3) 離心或過濾除去沉淀。
4) 用10%的小牛血清或正常人血清(PBS緩沖液)將收集的血清稀釋至所需的濃度。如
能用正常的人血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測標本。
5) 抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿，封口，20℃保存備用。不可反復凍融。
被檢物要求檢出的水平常被認為是質控血清應選擇的水平。如果該試驗還有其它要
求，則應加所要求濃度的質控物。
6) 標定含量。20-30次測定結果刪除>±2SD數據的均值作為靶值，并與已知定值血清對
比測定。
5.3 室內質量控制程序
臨床檢驗的檢測結果，每次或每天之間不可能沒有誤差。決定允許的誤差范圍，以臨
床上不造成誤診與漏診為準，通過以下步驟來確定質控范圍。
1) 最佳條件下的測定誤差。
2) 已知值的血清在常規檢驗條件下的誤差。
3) 未知值的血清在常規檢驗條件下的誤差。
4) 臨床應用的要求。對任何一個試驗都應確定一個允許的誤差范圍，前題是滿足臨床要
求。如允許誤差定得過小，在臨床上不存在任何意義，但為了符合該規定卻要花費很大人
力、物力和時間。相反，如果將允許誤差定得過大，將使監測系統察覺不到臨床上要求檢
出的誤差，失去質控的意義。
5.3.1 最佳條件下已知值質控血清變異(optimal conditions variance,簡稱OCV)的測定
在本實驗室最佳條件下(包括操作者、試劑、儀器等)檢測質控血清20-30次，測得
結果計算，求出該組數據的均值和標準差(SD)表示該實驗室的最佳工作質量。
現舉例說明HBsAg ELISA法檢測時OCV的測定。使用的質控制血清為臨界血清，
HBsAg濃度為5ng/ml。在該實驗室中選擇素質最好、操作最熟練的技術員進行認真地專門
測定，選用最佳的試劑盒，檢測之前，將恒箱、加樣器等認真校正、調校正、調試，使用
新的加樣吸頭等，即在最佳、最理想的條件下進行檢測。除質控血清外同時測定陰性對照
品和陽性對照品。并作雙份測定，得出2個吸光值(A值)，求出X。連續作20次，求出20
個X，即X1……X20。從這20個數據中，求出OCV的X和SD。
5.3.2常規條件下已知值質控血清變異(routine conditions variance-known value,簡稱
RCVK)的測定。
做常規檢驗的技術人員，在常規檢驗的條件下，將質控血清放在常規檢測樣本中，進
行20次檢驗，結果計算同OCV法。一般認為RCV的SD在OCV的SD兩倍范圍內可以接受。
若太大應該查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改進實驗室條件后(例如較正加樣
器，糾正洗板操作，調正溫育溫度等)，重新進行RCVK的測定。如果RCVK的SD值更
小，說明OCV不是最佳條件下測定的，應重新再測OCV。常規條件下，RCVK肯定要比
OCV大。通過質控控制各項條件，使RCVK的數據盡可能接近OCV值。RCVK的數據反映
該實驗室日常工作的質量，用于作質控圖，對室內檢驗的結果進行控制，每日檢驗的結
果，報告能否發出。
5.3.3常規條件下,未知值質控血清變異(routine conditions variancl-unknown value 簡稱
RCVU)的測定
有時為了避免主觀性,再作RCVU測定。
測定步驟同RCVK，但檢測的操作者不知質控血清的定值，或在操作者不知哪份是質
控血汪清的條件下進行常規檢驗，以排除操作者的主觀性。在此不再舉例說明。
5.3.4質控圖
通過以上三步驟，可以開始作室內質控圖，根據RCVK的和SD作質控框圖。利用質控
圖可以對每次檢驗的結果進行監測，當沒有更換另一批號試劑盒和另一批號質控血清時，
該質控圖可以連續作下去。
質控血清的S/CO值低于-2SD的范圍,屬"告警"，應尋找原因并在質控圖上記錄查出的
原因。
ELISA試驗中，各種檢驗項目的誤差允許范圍均有待在實踐中得出結論，以上只是舉
例說明質控方法，不是定論。2SD是一般公認的允許誤差限度。每批測定放一份質控血清
時，一次超過2SD應作為"告警"，二次超出2SD為"失控"。當質控過程中，出現失控時，出
現失控時，應查找原因，通常是試劑盒或質控血清失效造成。更換試劑盒或更換質控血
清，找出原因糾正后重新檢驗。如果檢驗結果仍達不到要求或找不到原 因時，應重復進
行OCV的檢驗。如果OCV檢驗的結果仍是好的，說明常規操作出現問題。
一般認為：①一次超出3SD；②連續二次超出2SD；③3-5次連續處于一側的2SD之內；
④5～7次連續偏向橫軸的一側，均為失控。
第③、④種情況，單獨依靠記錄往往是不易察覺的，但在質控圖上可以清晰地發現這種失
控。
5.3.5統計學計算方法--"即刻性"質控
以上介紹的質控方法基本上與臨床化學測定的質控方法相同，但ELISA有其特殊性，
最合適的質控方法尚待研究建立。有些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA
試劑盒效期短，用一批號試劑盒連續常規測20次，難度較大。采用"即刻法"質控統計方
法，只需連續測3次，即可對第3次檢驗結果進行質控。
"即刻法"的建立具體計算方法如下：
1)先將測定值從小到大排列
2)計算X和SD。
3)計算SDI上限和SDI下限值。
4)將SDI上限、SDI下限值與SDI值中的數字比較。當SDI上限值和SDI下限值＜n2SD時，表
示處于控制范圍內，可以繼續往下測定，繼續重復以上各項計算；當SDI上限和SDI下限
有 一值處于n2SD和n2SD值之間時，說明該值在2SD~3SD范圍，處于"告警"狀態；當
SDI上限和SDI下限有一值＞n2SD時，說明該值已在3SD范圍之外，屬"失控"。數值處
于"告警"和"失控"狀態應舍去，重新測定該項質控血清和病人樣本。舍去的只是失控
的這次數值，其他次測定值仍可繼續使用。
即刻性質控統計方法，適于ELISA測定的質控。
當檢測的數值超過20次以后，不必再使用"即刻法"質控統計計算，可以轉入常規的質
控圖的質控。將前20次的數值求出的和SD作質控框架圖，第21次的數值，依次點入即
可。
5.4室間質量評價(external quality assessment,簡稱EQA)
室間質量評價簡稱室間質評，是由質控中心采用一系列的辦法連續地、客觀地評價各
實驗室的試驗結果，并發現室內質控不易發現的不準確性，了解各實驗室之間結果的差
異，并幫助校正，使具有可比性。各實驗室試驗結果報到質控中心，經過統計分析，得出
相互比較的結果。這種評價不能控制各實驗室每天發出的檢驗報告，而是一種回顧性評
價。室內質控主要監測試驗結果的精密度，而室間質評主要控制試驗結果的準確度，不能
互相替代。參與質評的實驗室應先做好室內質控。
5.4.1室間質評的方法
1、 發質控物進行調查
這是國內外室間質評的常用形式。部臨檢中心對乙肝標志物ELISA檢驗的室間質評采
用定期發放質控物至各實驗室，各實驗室在規定的日期進行檢驗，并將檢驗結果報至部臨
檢中心。部臨檢中心經統計分析，將評價結果寄回各實驗室。通過評價，各實驗室了解本
室工作質量，發現差距，并設法改進，以不斷提高檢驗質量。
這種評價方式有一定缺點，即各實驗室常對質控物特殊對待，在檢驗時選用特殊試劑
盒，選派特別的技術員進行檢驗，有的實驗室互相和對結果并作修改。這就使EQA的結果
不能反映該實驗室日常工作水平。
2、 派觀察員到實驗室進行試劑調查
這種調查事先不通知，臨時派觀察員到實驗室，指定采用常規方法，檢驗規定的一組
標本，進行評價。
這種調查方式，容易發現該實驗室存在的實際問題，可以直接給予指導和幫助，解決
問題，提高檢驗質量。這種調查通常可以使用真實樣本，避免采用質控物的一些缺點。
